5. トランスクリプトーム解析
5.1 RNA-seq解析の基礎
RNA-seqの原理と技術:
- mRNAの逆転写とシークエンシング
- ストランド特異的プロトコル
- 全長転写産物解析（Full-length RNA-seq）
定量化アルゴリズム:
class RNAseqQuantifier:
"""RNA-seq発現定量"""
def __init__(self, transcriptome_index):
self.index = transcriptome_index
def quantify_expression(self, fastq_files):
"""
転写産物の発現量推定
Returns:
TPM, FPKM値
"""
# 疑似アライメント（Kallisto/Salmon風）
counts = self.pseudoalignment(fastq_files)
# 長さ補正とライブラリサイズ補正
tpm = self.calculate_tpm(counts)
return tpm
5.2 差次的発現解析
統計モデル:
import numpy as np
from scipy import stats
class DifferentialExpression:
"""差次的発現遺伝子の検出"""
def __init__(self, count_matrix, conditions):
self.counts = count_matrix
self.conditions = conditions
def deseq2_style_analysis(self):
"""
DESeq2スタイルの負の二項分布モデル
"""
# サイズファクター推定
size_factors = self.estimate_size_factors()
# 分散推定
dispersions = self.estimate_dispersions()
# Wald検定
results = self.wald_test(dispersions)
# 多重検定補正（Benjamini-Hochberg）
padj = self.adjust_pvalues(results['pvalue'])
return results
遺伝子セット解析:
- Gene Ontology（GO）エンリッチメント
- KEGG パスウェイ解析
- GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）
5.3 選択的スプライシング解析
イベント検出:
- Exon skipping
- Alternative 5’/3’ splice sites
- Intron retention
- Mutually exclusive exons
定量化と統計解析:
class SplicingAnalyzer:
"""選択的スプライシング解析"""
def detect_splicing_events(self, bam_file):
# ジャンクションリードの検出
junctions = self.extract_junctions(bam_file)
# PSI（Percent Spliced In）値の計算
psi_values = self.calculate_psi(junctions)
return psi_values
🎯 認定試験ポイント
重要概念チェックリスト
RNA-seq基礎 ⭐⭐⭐
- RNA-seqとマイクロアレイの技術的違いと適用場面を理解している
- リードカウント・RPKM・FPKM・TPMの違いと正規化手法を説明できる
- バッチ効果と技術的バイアスの除去手法を把握している
- 発現変動遺伝子（DEG）検出の統計的原理を理解している
転写制御機構 ⭐⭐⭐
- 転写因子・エンハンサー・プロモーターの役割を説明できる
- 選択的スプライシングの種類（エクソンスキップ・結合部位選択等）
- 非コードRNA（miRNA・lncRNA・circRNA）の機能を理解している
- 遺伝子発現制御ネットワークの構築手法を把握している
single-cell解析 ⭐⭐
- scRNA-seqとbulk RNA-seqの違いと技術的課題を理解している
- 細胞型クラスタリングと疑似時間解析の原理
- ドロップアウト（零過多データ）への対処法
- 細胞軌跡推定（trajectory inference）の手法
機能解析・パスウェイ解析 ⭐⭐
- Gene Ontology（GO）の階層構造と enrichment解析の原理
- KEGGパスウェイデータベースの構成と解析手法
- Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）の統計的手法
- 共発現ネットワーク（co-expression network）の構築
典型的な出題パターン
【正規化・定量化】
問題例: 遺伝子Aの生リードカウントが1000、遺伝子長3kb、
総リードカウント50Mの場合、TPM値は？
解答:
1) RPK = 1000 / (3000/1000) = 333.3
2) スケールファクター = 50,000,000 / 1,000,000 = 50
3) TPM = 333.3 / 50 × 1,000,000 = 6,666 TPM
【統計解析】
問題例: DESeq2での発現変動遺伝子検出において、
負の二項分布を使用する理由を説明せよ。
解答: RNA-seqのカウントデータは分散が平均より大きい過分散を示すため。
負の二項分布は平均と分散を独立してモデル化でき、
生物学的および技術的バリエーションを適切に考慮できる。
【技術比較】
問題例: bulk RNA-seqとsingle-cell RNA-seqの利点・欠点を比較せよ。
解答:
bulk RNA-seq: 高感度・低コスト・確立された解析法 / 細胞不均一性情報失失
scRNA-seq: 細胞レベル解像度・稀少細胞検出 / 低感度・高コスト・技術ノイズ
【バイオロジー統合】
問題例: RNA-seqで同定した発現変動遺伝子群の生物学的意味を
調べるための解析ステップを順序立てて説明せよ。
解答:
1) GO enrichment解析で機能分類
2) KEGGパスウェイ解析で代謝経路関連を特定
3) 転写因子結合サイト解析で制御機構推定
4) 既知疾患遺伝子データベースとの照合
5) 文献調査による生物学的妥当性検証
関連する付録・章
- 付録G: 認定試験全体の対策情報
- 付録H: トランスクリプトーム解析ツール・データベース一覧
- 第4章: ゲノム解析技術（DNA解析との比較）
- 第6章: エピゲノム・マルチオミクス解析（統合解析）
- 第13章: 機械学習・AI手法（高度な解析手法）
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